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    蛋白质纯化系统百科

    蛋白质纯化与结晶的原理 获得蛋白质的晶体结构的第一个瓶颈,就是制备大量纯化的蛋白质(>10mg),其浓度通常在10mg/ml以上,并以此为基础进行结晶条件的筛选。运用重组基因的技术,将特定基因以选殖(clone)的方式嵌入表现载体(expression vector)内,此一载体通常具有易于调控的特性。之后再将带有特定基因的载体送入可快速生长的菌体中,如大肠杆菌(Escherichia coli),在菌体快速生长的同时,也大量生产表现载体上的基因所解译出之蛋白质。一般而言纯度越高的蛋白质比较有机会形成晶体,因此纯化蛋白质的步骤就成为一个重要的决定因素。 在取得高纯度的蛋白质溶液后,接下来就是晶体的培养。蛋白质晶体与其他化合物晶体的形成类似,是在饱和溶液中慢慢产生的,每一种蛋白质养晶的条件皆有所差异,影响晶体形成的变量很多,包含化学上的变量,如酸碱度、沉淀剂种类、离子浓度、蛋白质浓度等;物理上的变数,如溶液达成过饱和状态的速率、温度等;及生化上的变数,如蛋白质所需的金属离子或抑制剂、蛋白质的聚合状态、等电点等,皆是养晶时的测试条件。截至目前为止,并无一套理论可以预测结晶的条件,所以必须不断测试各种养晶溶液的组合后,才可能得到一颗完美的单一晶体。 蛋白质晶体的培养,通常是利用气相扩散法(Vapor Diffusion Method)的原理来达成;也就是将含有高浓度的蛋白质(10~50mg/ml)溶液加入适当的溶剂,慢慢降低蛋白质的溶解度,使其接近自发性的沈淀状态时,蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体。举例来说,我们将蛋白质溶于低浓度(~1.0M)的硫酸铵溶液中,将它放置于一密闭含有高浓度(~2.0M)硫酸铵溶液的容器中,由气相平衡,可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度,进而达成结晶的目的。 蛋白质晶体在外观上与其他晶体并无明显不同之处,但在晶体的内部,却有很大的差异。一般而言,蛋白质晶体除了蛋白质分子外,其他的空间则充满约40%至60%之间的水溶液,其液态的成分不仅使晶体易碎,也容易使蛋白质分子在晶格排列上有不规则的情形出现,造成晶体处理时的困难及绕射数据上的搜集不易等缺点。但也由于高含水量的特性,让蛋白质分子在晶体内与水溶液中的状态,极为相似。所以由晶体所解出的蛋白质结构,基本上可视为自然状态下的结构。

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